Search

Filter Stream

Select the types of content you would like to see.

Top Tracks / View All

  • Close

    Press esc to close.
    Close
    Press esc to close.
    Close

    Connecting to your webcam.

    You may be prompted by your browser for permission.

    Атомная модель вируса бромовой мозаики с использованием прямого обнаружения электронов и оптимизации в реальном пространстве

    1. Получение изображения с использованием режима интеграции с DE-12 Камеры с зарядовой связью (ПЗС)...
    2. Оценка SSNR в разных суммах кадров
    3. 3D реконструкции с использованием различных комбинаций сумм кадров
    4. Дополнительная проверка оценки разрешения
    5. Оценка B- фактора карты
    6. Подход к созданию и проверке моделей
    7. Сегментируйте и усредните три субъединицы в пределах асимметричной единицы
    8. Модели de novo Cα для каждой карты субъединиц
    9. Всеатомное моделирование и оптимизация в реальном пространстве
    10. Масштабирование пикселя карты cryo-EM
    11. Всеатомные модели для асимметричной единицы и ее соседей
    12. Оценка крио-ЭМ модели и вариации карты
    13. Сравнение моделей всех атомов между крио-ЭМ и кристаллом

    Получение изображения с использованием режима интеграции с DE-12

    Камеры с зарядовой связью (ПЗС) широко используются, несмотря на их относительно низкое отношение сигнал / шум (ОСШ) на средних и высоких пространственных частотах. 9 , 10 , Совсем недавно разработка радиационно-упрочненных детекторов на основе металл-оксидного полупроводника (CMOS), которые могут непосредственно обнаруживать первичные электроны в электронном микроскопе, доказала свою превосходную альтернативу ПЗС-камерам. Эти новые прямые детекторы были успешно использованы для сбора данных в крио-ЭМ (например, см. Ссылки 2 , 3 , 11 , 12 ). В дополнение к улучшению спектрального SNR (SSNR) полученных изображений 12 , 13 Камеры прямого обнаружения также обеспечивают преимущество внутреннего дробного дозирования за счет записи нескольких изображений на область образца в рамках одной непрерывной экспозиции (далее мы называем этот тип сбора данных «фильмом», а каждое отдельное изображение в фильме - «кадром»). ). Кадры могут быть подготовлены индивидуально или в группах перед использованием для реконструкции изображения 2 , 3 , 14 ,

    Камеры прямого обнаружения могут работать в двух разных режимах: режим интегрирования или режим счета электронов 15 , 16 , Режим подсчета обрабатывает каждое электронное событие индивидуально, чтобы нормализовать энергию, выделяемую каждым падающим электроном, и / или пытаться более точно локализовать каждый падающий электрон. Это требует очень низкой экспозиции на кадр и очень высокой частоты кадров камеры, чтобы различать отдельные электронные события. Следовательно, современные реализации режима подсчета обычно требуют гораздо более длительного времени экспонирования, чем режим интегрирования. 2 , 13 , Напротив, интегрирующий режим генерирует кадры путем суммирования сигнала, генерируемого всеми падающими электронами в каждом пикселе, без попытки различить каждое электронное событие. Следовательно, режим интегрирования не ограничен интенсивностью луча и частотой кадров устройства, и получение изображения может использовать более короткое время экспозиции для увеличения пропускной способности и уменьшения общего количества движения образца из-за нестабильности стадии образца.

    В этом исследовании мы использовали систему камер DE-12 (Direct Electron, LP), состоящую из 4096 × 3072 датчика прямого обнаружения с обратным истончением (DDD), работающего в режиме интеграции. Эта камера была установлена ​​в камере для фотопленки электронного микроскопа JEM-3200FSC (JEOL, Токио, Япония), работающего при 300 кВ с энергетическим фильтром в колонке (с шириной энергии 20 эВ).

    BMV наносили на тонкую непрерывную углеродную подложку (см. Методы), чтобы улучшить распределение частиц и уменьшить вызванное пучком движение образца. Изображения были записаны при номинальном увеличении микроскопа × 50000, что соответствует увеличению детектора × 60000. Каждый фильм снимали со скоростью 25 кадров в секунду в течение 1,5 с, а скорость экспонирования образца составляла ~ 35 e − Å − 2 с − 1. Таким образом, каждая область образца была отображена с кумулятивной экспозицией ~ 52 э-Å-2, распределенной по 37 кадрам. Это кумулятивное воздействие в 2–3 раза превышает типичное число, используемое для исследований крио-ЭМ с высоким разрешением. Различные подмножества этих кадров были использованы для обработки, как описано ниже.

    Оценка движения частиц

    Методы обработки кадров могут быть выполнены двумя способами: (1) выравнивание отдельных кадров или групп кадров или коробчатых частиц из этих кадров перед суммированием, чтобы компенсировать движение образца и / или зарядку во время записи данных 2 , 3 , 14 и / или (2) суммирование различных комбинаций кадров для генерации разных изображений частиц, используемых отдельно для определения ориентации частиц и для создания карты 4 , Здесь мы оцениваем новые способы обработки кадров DDD для повышения эффективности обработки изображений и оптимизации разрешимости финальной реконструкции.

    Частицы отбирались с использованием суммы всех кадров в фильме (без выравнивания или других процедур обработки), что обеспечивало достаточный контраст для идентификации частиц. Координаты частиц затем использовались для извлечения одной и той же частицы из каждого из 37 кадров. Затем мы оценили движение каждой из ~ 30 000 выбранных частиц в течение всей их 1,5-секундной экспозиции. Чтобы оценить движение частицы, мы суммировали три последовательных кадра для каждой частицы (что соответствует экспозиции 4,2 е-Å-2) в разные моменты времени в фильме. Рисунок 1а показывает гистограмму наблюдаемого поступательного сдвига набора данных ~ 30 000 частиц между начальной временной точкой (кадры 2–4) и либо промежуточной временной точкой (кадры 10–12), либо конечной временной точкой (кадры 34–36) , Движение частицы, которое мы наблюдали, было относительно небольшим, со средним отклонением всего ~ 1,5 Å между начальной и средней временными точками и средним отклонением ~ 2,1 Å между начальной и конечной точками времени. Было обнаружено, что только ~ 8% частиц движутся> 3,3 Å (что соответствует разрешению нашей окончательной карты плотности, усредненной по субъединицам в асимметричной единице, см. Подробности ниже) в течение всей экспозиции. Это отличается от предыдущих сообщений о наблюдаемом существенном движении, требующем вычислительной коррекции движения для восстановления одиночной частицы при аналогичном разрешении 2 , 3 , 14 , Одним из возможных объяснений наблюдаемой стабильности образца в наших данных было использование непрерывной углеродной поддерживающей пленки, которая может обеспечить механическую стабильность и / или минимизировать заряд за счет увеличения электропроводности образца. 17 , Поскольку обнаруженное движение было относительно небольшим (приблизительно эквивалентным обратной величине частоты Найквиста условий формирования изображения), мы не включили коррекцию движения в последующую обработку изображения.

    Рисунок 1: Оценка движения частиц и SSNR с использованием кадров фильма.

    ( a ) Гистограмма, показывающая движения частиц, оцененные путем сравнения трехкадровых средних значений в начале, середине и конце каждого фильма. Суммарное воздействие составило ~ 53 е-Å-2, накопленное за 1,5 с. ( b ) Слева - увеличенная часть суммированной рамки (2–12). Правильно, 1D SSNR из 92 частиц BMV, вычисленных по этому кадру. ( c ) То же, что b , из суммированных кадров 2–36. ( d ) То же, что и c , для суммированных кадров 2–36, с компенсацией ущерба для каждого кадра.

    Оценка SSNR в разных суммах кадров

    Хотя большая часть наших данных, по-видимому, не подверглась воздействию значительной зарядки или движения образца, это не гарантирует сохранность данных с высоким разрешением. Затем мы оценили SSNR путем вычисления одномерного (1D) спектра мощности для различных сумм кадров в фильме. Левая панель Рис. 1б, в показан пример части всего кадра, суммированной из кадров 2–12 и 2–36 соответственно, а на правой панели показан 1D SSNR из 92 частиц (размер блока 420 × 420 пикселей), выделенных из соответствующих суммированных кадров. Хотя мы не корректировали движение во время экспонирования, первые два кадра (кадры 0 и 1) были удалены из-за медленной разблокировки луча в нашем микроскопе и известного начального перемещения образца и / или зарядки, вызванного пучком 2 , 18 , Спектр мощности в Рис. 1б использовали кумулятивное воздействие на образец ~ 18 е-Å-2, что считается безопасным воздействием для исследований крио-ЭМ высокого разрешения 19 , 20 ,

    Левая панель Рис. 1с представляет совокупное воздействие на образец ~ 53 е-Å-2 для той же площади образца, что и в Рис. 1б , При таком увеличенном кумулятивном воздействии признаки высокого разрешения в биологических макромолекулах повреждаются 19 , 20 , 21 , Чтобы исключить эти данные из поврежденного образца, мы применили взвешенную фильтрацию радиационного повреждения к каждому кадру перед суммированием (далее называемым «компенсацией ущерба»). Это серия фильтров нижних частот, применяемых к каждому кадру, смоделированных после исчезновения элементов высокого разрешения в результате радиационного повреждения, как описано ранее 19 , 20 , Используя этот метод компенсации ущерба (см. Дополнительные методы ), общая контрастность изображения при низком разрешении была увеличена в 1,25-2 раза при сохранении сигнала высокого разрешения ( Рис. 1б – г ). Этот коэффициент не связан линейно с количеством усредняемых кадров (см. Дополнительные методы а также Дополнительный рис. 1 ).

    3D реконструкции с использованием различных комбинаций сумм кадров

    Наша цель - создать структуру с наилучшим качеством и разрешением на основе данных в режиме кино прямого обнаружения. Для этого мы выполнили несколько реконструкций, используя различные суммы кадров и компенсацию ущерба. Для правильной оценки разрешения наших окончательных карт плотности и дальнейшей проверки наших реконструкций мы следовали процедуре золотого стандарта, то есть делили весь набор данных частиц на два отдельных набора данных перед дальнейшей обработкой изображения и трехмерной реконструкцией. 22 , 23 , В каждом подмножестве данных использовалась независимая исходная модель, сгенерированная starticos из EMAN1 (ссылка 24). 24 ( Рис. 2 ), который строит грубую реконструкцию из частиц, близких к пяти, трем и двум осям симметрии. Многолучевой моделируемый отжиг (MPSA) 25 был использован для быстрого уточнения карты до 5 Å. MPSA использует перекрестные общие линии в пространстве Фурье для одновременного определения как центра, так и ориентации изображения частицы. Когда независимые реконструкции достигли разрешения ~ 5 Å, мы переключились на EMAN1 и использовали более точный поиск ориентации частиц ( Дополнительный рис. 2 ). Разрешение оценивалось по критерию корреляции оболочки Фурье (FSC) 0,143 между двумя независимыми реконструкциями с внутренней маской для удаления РНК, которой не хватает общей икосаэдрической симметрии. Маска имела гауссов профиль с шириной 5 Å, чтобы избежать резких эффектов края маски, которые могут вызвать преувеличение разрешения. Затем из всех данных была сгенерирована комбинированная карта и отфильтрована. Масштаб размера карты был уточнен в процессе оптимизации модели (Методы). Все заявленные разрешения основаны на окончательно скорректированном масштабе карты 0,99 Å пиксель-1.

    Рисунок 2: Карты плотности Cryo-EM двух независимых наборов данных и трехмерных реконструкций после 38 итераций уточнения.Рисунок 2: Карты плотности Cryo-EM двух независимых наборов данных и трехмерных реконструкций после 38 итераций уточнения

    С картами, сгенерированными из наборов данных 1 и 2 ( а ) и их объединенными картами ( б ). Исходная модель для каждого набора данных / реконструкции была создана с использованием EMAN1. Последующее уточнение было рассчитано с использованием MPSA. Последние пять итераций были завершены в EMAN1, в результате чего были получены окончательные трехмерные карты плотности.

    Определение локализации и ориентации частиц в значительной степени зависит от сигнала низкого разрешения. 26 , Отдельные кадры, собранные с камеры DDD, можно манипулировать для оптимизации контраста низкого разрешения. Мы использовали изображения частиц, обработанные с компенсацией повреждений, чтобы определить ориентацию частиц. Затем мы применили эти ориентации частиц для создания различных карт плотности, используя изображения частиц, полученные из различных сумм кадров. Используя сумму кадров 2–36 с компенсацией ущерба, была получена карта с разрешением 3,8 Å ( Дополнительный Рис. 3 ). Аналогичная карта разрешения была также получена из суммы кадров 2–12 без компенсации ущерба ( Дополнительный Рис. 3 ). Однако, если мы использовали ориентации частиц, определенные исключительно из суммы кадров 2–12 без компенсации ущерба, разрешение составляло 4,2 Å. Это может быть связано с плохим определением ориентации из-за относительно низкого контраста частиц. Это говорит о том, что улучшенный контраст от фильмов с DDD с высокой выдержкой и компенсацией повреждений дает более точное определение ориентации частиц.

    Дополнительная проверка оценки разрешения

    На оценку разрешения по золотому стандарту между двумя независимо определенными картами могут влиять такие факторы, как маскирование, фильтрация и усреднение неакосаэдрической симметрии в комплексе. Чтобы смягчить потенциальное чрезмерное уточнение, которое приведет к чрезмерно оптимистическому значению разрешения, мы рандомизировали фазы данных частиц за пределами 10 Å, а затем повторили процедуру уточнения. Из-за отсутствия самосогласованных данных надежная процедура уточнения не должна приводить к разрешению, которое превышает 10 Å. Значительное расширение этого разрешения является показателем смещения модели. Эта обработка была применена к двум независимым наборам данных, и резкое падение наблюдалось при 10 Å ( Рис. 3а ). Согласно недавно предложенной формуле 2 «Истинное FSC» вычисляется из FSC исходного набора данных и FSC рандомизированного набора данных фазы. Результат этой оценки разрешения был идентичен полученному из кривой FSC золотого стандарта между двумя независимыми реконструкциями ( Рис. 3а ).

    Рисунок 3: Подтверждение разрешения окончательной карты плотности крио-ЭМ.Рисунок 3: Подтверждение разрешения окончательной карты плотности крио-ЭМ

    ( a ) Кривые FSC, рассчитанные с использованием трех различных методов (с пометкой) между двумя независимыми трехмерными реконструкциями, сгенерированными из двух разных наборов данных. ( б ) Кривые FSC по золотому стандарту для карт окончательной плотности до и после усреднения QES. ( c ) Кривые FSC золотого стандарта карт плотности, полученные с использованием различного общего числа частиц. ( d ) Соотношение между различным количеством асимметричных единиц (эквивалентно 60 × общему количеству частиц на реконструкцию) и разрешением для каждой реконструкции, как определено в Рис. 3с , Каждая точка данных относится к разрешению золотого стандарта и общему количеству частиц для каждой реконструкции соответственно. Линейное соответствие наименьших квадратов этого отношения привело к общему B- фактору 165 Å2.

    Оценка B- фактора карты

    Разрешение карты зависит от множества факторов, включая количество частиц (каждая из которых содержит 60 асимметричных единиц в случае икосаэдрической частицы, такой как BMV), движение образца или стадии, функции огибающей условий формирования изображения, передаточная функция модуляции детектора , ошибка оценки ориентации и различные вычислительные ошибки на всех этапах реконструкции 25 , 27 , 28 , Совокупный эффект всех этих факторов может быть аппроксимирован как функция Гаусса, где падение интенсивности Фурье, как функция разрешения, связано с количеством асимметричных единиц и « B- фактором» 27 , B- фактор является отличным показателем того, сколько данных необходимо для достижения определенного разрешения в данной экспериментальной и вычислительной обстановке для данного образца. B- фактор может быть аппроксимирован путем оценки разрешения (как определено выше с двумя независимыми картами) различных реконструкций с использованием различных подмножеств частиц из всего набора данных ( Рис. 3с ). Наблюдаемое разрешение для различного числа частиц дало общий B- фактор для наших данных ~ 165 Å2, определенный по наклону Рис. 3d , Исходя из этого B- фактора, для разрешения карты (с наложенной икосаэдрической симметрией) 4,5 Å требуется всего 8 274 икосаэдрических частиц (то есть 496440 асимметричных единиц), тогда как для разрешения 3,0 Å потребуется на несколько порядков больше частиц (то есть , более двух миллионов икосаэдрических частиц). Небольшой сдвиг в B- факторе резко изменит количество частиц, необходимых для достижения этого диапазона почти атомного разрешения при данных условиях эксперимента и вычислительных протоколах. Таким образом, улучшения в инструментальных и / или вычислительных протоколах могут снизить общий B- фактор, а для реконструкции, нацеленной на конкретное разрешение, потребуется меньше частиц. Приведенная выше оценка предполагает, что структура всех частиц совпадает с целевым пределом разрешения. Если частицы не являются конформационно идентичными и остаются смешанными при реконструкции, а не разделены на однородные классы, разрешение не улучшится при использовании большего количества частиц.

    Подход к созданию и проверке моделей

    Получение оптимальной и проверенной модели из карты плотности крио-ЭМ является конечной целью структурных исследований с высоким разрешением. Чтобы быть уверенными в нашей реконструкции, молекулярных моделях и умозаключениях, оценка разрешения по золотому стандарту была сделана еще на шаг вперед благодаря использованию промежуточных карт для оценки потенциальных структурных изменений в наших данных и их влияния на молекулярные модели. Оценка разрешения по золотому стандарту требует, чтобы весь набор необработанных данных (отдельных частиц) был разделен пополам (непосредственно после отбора частиц) и уточнен независимо, создав две независимые карты плотности (Карта B1 и B2, Дополнительный рис. 2 ). Окончательная карта была сгенерирована из объединенных данных (Карта B). Модели были построены независимо от каждой из этих трех карт, чтобы избежать смещения. Сравнивая разницу между двумя моделями, которые использовали половину данных, мы можем оценить уровень детализации, которому мы можем доверять в окончательной модели. Это дает представление о потенциальной неопределенности, которая возникает во время генерации модели.

    Сегментируйте и усредните три субъединицы в пределах асимметричной единицы

    Поскольку рентгеновская кристаллическая структура BMV была определена ранее 8 Кристаллическая структура могла бы просто соответствовать плотности крио-ЭМ, которую мы создали. Однако для тестирования протокола молекулярного моделирования de novo и нашей недавно разработанной процедуры оптимизации в реальном пространстве ( Дополнительный Рис. 4 ), мы смоделировали структуру без привязки к кристаллической структуре. Следующие шаги описывают процедуры, используемые для генерации трех оптимизированных, независимых полностью-атомных моделей в полуавтоматическом режиме без априорного знания структуры BMV.

    В пределах одной асимметричной единицы BMV ( T = 3) есть три квазиэквивалентных субъединицы капсидного белка, которые мы сегментировали с использованием Segger 29 , 30 ( Рис. 4а ), расширение для UCSF Chimera, которое выполняет полуавтоматическую сегментацию карт на основе плотности соединения. Разрешимость наших карт плотности была такова, что границы между субъединицами можно было легко наблюдать, и мы смогли выделить три отдельные субъединицы в пределах одной асимметричной единицы. Три сегментированных QES были затем выровнены с использованием Foldhunter 31 , который выполняет исчерпывающее вращение твердого тела и поисковый перевод плотности. Выровненные QES были затем усреднены для улучшения видимости сохраняемых объектов на карте плотности. Усреднение QES обычно приводит к значительному снижению шума 32 и улучшенное соединение субъединиц по сравнению с невостребованными субъединицами 33 , Таким образом, способность определять белковые складки улучшается. FSC между средними значениями QES двух независимых карт BMV (карты E1 и E2, Дополнительный рис. 2 ) показал, что разрешение улучшилось до 3,3 Å ( Рис. 3б ). Хотя усредненная по QES и отфильтрованная по нижним частотам карта не предполагает каких-либо существенных структурных различий между QES, она облегчает первоначальное установление трассы цепочки с использованием Pathwalker 34 с повышенной уверенностью. Чтобы учесть это межсубъектное изменение, для получения окончательных моделей были использованы карты средней плотности.

    Рисунок 4: Карты плотности и связанные модели сегментированных субъединиц в асимметричной единице.

    ( а ) Сегментированная плотность одной асимметричной единицы из окончательной комбинированной карты плотности крио-ЭМ. Субъединица A синего цвета, субъединица B зеленого цвета, а субъединица C красного цвета. ( б ) Окончательные оптимизированные модели отображаются с соответствующими сегментными картами плотности. Различное количество аминокислот было видно для конечных плеч в каждой субъединице из-за неупорядоченных областей плотности.

    Модели de novo Cα для каждой карты субъединиц

    Цепная топология из карт, усредненных по QES, была создана с использованием Pathwalker 8 и конвейер моделирования de novo ( Дополнительный Рис. 5 ). Pathwalker заполняет карту плотности (Карта E, E1 и E2, Дополнительный рис. 2 ) с 164 псевдоатомами (уменьшающими 189 атомов Cα на 25 из-за потенциально гибких концевых областей капсидных субъединиц), приближающими атомы Cα. При этом разрешении карта плотности имеет разделение β-нитей, и полученная модель сопоставляет эту плотность с соответствующими β-листами. Более того, обе конечные области можно было бы различить на карте и в модели. Небольшие ручные корректировки были сделаны с помощью Gorgon 35 интерактивный инструмент моделирования, разработанный для построения начальных моделей с использованием карты плотности в качестве ограничения, корректирующего расстояния Cα – Cα, сгенерированные в Pathwalker. Эта окончательная модель использовалась в качестве шаблона для генерации моделей всех атомов для каждого из трех QES. При размещении этого шаблона на трех отдельных картах субъединиц, которые вместе составляют одну асимметричную единицу, мы отмечаем, что область, включающая аминокислоты LYS41-PRO178 (далее обозначаемая как ядро), была структурно консервативной, но что разрешимость концевых остатков варьировалась для каждого подразделение ( Рис. 4б ).

    Всеатомное моделирование и оптимизация в реальном пространстве

    Затем мы преобразовали нашу карту Cα-магистрали в полностью-атомную структуру для ядра капсида, используя REMO-сервер. 36 , Ошибки регистрации (сдвиг в последовательности по сравнению с смоделированным расположением аминокислот) при размещении аминокислот были отмечены на основе видимых плотностей ароматических остатков и вручную исправлены с использованием COOT. N-концевые остатки были добавлены для субъединиц, которые имели видимую плотность 37 , Каждая модель трех субъединиц в асимметричной единице была оптимизирована в соответствующих картах плотности ( Рис. 4б ). Для обеспечения надлежащего соответствия плотности, сохраняя при этом хорошие стереохимические и ротамерные назначения, мы разработали новую подпрограмму оптимизации в реальном пространстве, называемую phenix.real_space_refine (базовая реализация, описанная в ref. 38 ) в кристаллографическом программном пакете Phenix 39 , Традиционно Phenix и другие кристаллографические пакеты выполняют оптимизацию модели во взаимном пространстве, улучшая модель по отношению к рентгеновским кристаллографическим данным и, таким образом, генерируя обновленную информацию о фазе для расчетов электронной плотности. 38 , Альтернативный подход - выполнить оптимизацию в реальном пространстве с целью улучшения модели, но не изменения карты плотности, как в нашем случае. Уточнение в реальном пространстве давно используется в рентгеновской кристаллографии, в частности, в контексте построения (пере) интерактивной модели 37 , 40 , 41 , Преимущества включают больший контроль над уточнением и ограничениями модели и быструю локальную оптимизацию модели. Мы объединили локальную оптимизацию модели реального пространства с несколькими геометрическими ограничениями и автоматической подгонкой ротамера для поддержания хорошей стереохимии. Кроме того, были добавлены ограничения вторичной структуры, чтобы поддерживать надлежащие расстояния между β-нитями на этапе уточнения ( Рис. 4б ). Каждый раунд оптимизации модели основывался на взаимной корреляции между картой и моделью как для основной, так и для боковых цепей, независимо и в комбинации ( Дополнительный фильм 1 ). Кроме того, статистика MolProbity (инструмент проверки структуры, обычно используемый в рентгеновской кристаллографии) контролировалась на предмет правильной геометрии белка. 6 , Дополнительное уточнение для регионов со слабой плотностью и отсутствием сильных модельных ограничений было выполнено вручную с помощью COOT.

    Масштабирование пикселя карты cryo-EM

    После нашего начального раунда оптимизации модели наши карты плотности были повторно откалиброваны для масштаба и резкости пикселей карты. В общем, точное увеличение электронного микроскопа не столь критично для низкого разрешения, как для исследований с высоким разрешением для получения точной атомной модели. На практике масштабирование пикселей окончательной карты может быть уточнено на этапе построения модели. Например, шаг α-спирали можно использовать для получения правильного масштаба пикселей карты, поддерживая правильную геометрию и имея хорошее прилегание к плотности. К сожалению, BMV в основном состоит из β-листов без α-спиралей достаточной длины для калибровки пикселя карты. Мы сгенерировали нашу начальную модель de novo, используя вычисленное значение масштаба карты 0,93 Å пиксель-1 из начальной калибровки увеличения с использованием графитированного углерода. Использование этого масштабирования для оптимизации более крупного комплекса (асимметричная единица, как описано в следующем шаге) вызвало ошибки подбора и привело к получению моделей, в которых отсутствовала правильная геометрия полипептида. При анализе баллов MolProbity наши полученные модели имели высокое столкновение и плохие баллы по Рамачандрану. Одной из возможных причин было то, что наш начальный масштаб пикселей карты был неточным. Поэтому мы скорректировали масштабирование пикселей карты на основе баллов модели, используя шкалы от 0,93 до 1,06 Å пиксель-1, оптимизируя нашу полностью атомную модель de novo для каждого масштаба. Оценки столкновения и график Рамачандрана были оценены для каждой оптимизированной модели в различных масштабах. Лучшие модели были получены, когда карта плотности была масштабирована до 0,99 Å пиксель-1.

    Очевидно, что мы могли бы масштабировать увеличение нашей крио-ЭМ карты, используя кристаллическую структуру. Мы решили не делать этого, потому что целью этого исследования была разработка вычислительного протокола для образца, не имеющего известной кристаллической структуры. Однако, чтобы подтвердить нашу процедуру масштабирования, мы впоследствии оценили взаимную корреляцию между различными масштабированными картами и кристаллической структурой. Итерируя ранее использовавшееся пиксельное масштабирование от 0,93 до 1,06 Å пикселя-1, мы измерили взаимную корреляцию между нашей картой плотности и смоделированной картой, сгенерированной из кристаллической структуры. Опять же, оптимальное значение взаимной корреляции было получено при 0,99 Å пиксель-1, подтверждая, что наш протокол масштабирования пикселей карты был правильным. Таким образом, оставшаяся часть наших оценок построения модели и разрешения (как сообщалось в Рис. 3 а также Дополнительный рис. 3а ) затем выполняли с использованием 0,99 Å пикселя-1.

    Всеатомные модели для асимметричной единицы и ее соседей

    После оптимизации модели реального пространства отдельных субъединиц капсида и настройки масштаба пикселей карты, как описано выше, был собран полный асимметричный блок ( Дополнительный Рис. 4 ). Из этих моделей был проведен дополнительный раунд оптимизации реального пространства для улучшения интерфейсов и устранения конфликтов. Асимметричная единица была итеративно смоделирована с использованием процедуры оптимизации реального пространства с незначительными ручными корректировками, сделанными в COOT. После пяти раундов оптимизации асимметричная единичная модель сходилась к окончательной асимметричной единичной модели с MolProbity и статистикой оценки столкновения в верхних 90% для структур с эквивалентным разрешением. На следующем уровне взаимодействий интерфейсы асимметричных единиц, семь окружающих асимметричных единиц были добавлены к исходной асимметричной единице, и оптимизация реального пространства была выполнена на этом комплексе ( Дополнительный фильм 2 ). После оптимизации в реальном масштабе времени наша модель показала хорошее соответствие плотности и получила высокий рейтинг с точки зрения геометрии белка и показателя столкновения ( Таблица 1 ) по сравнению с моделями в Банке протеиновых данных (PDB) 42 в эквивалентном разрешении. Рисунок 5 а также Дополнительный Рис. 6 показать примеры областей каждой субъединицы для их соответствия между плотностью и моделью с однозначной разрешимостью боковых цепей.

    Таблица 1: Статистика MolProbity, сравнивающая модели, полученные из карты крио-ЭМ до и после оптимизации реального пространства (RSO), и рентгеновская структура (идентификатор PDB: 1JS9).Рисунок 5: Детали боковой цепи из регионов в субъединице B показаны с картой и моделью.

    Оценка крио-ЭМ модели и вариации карты

    Чтобы проверить нашу карту и модель крио-ЭМ, мы изучили соответствие между двумя независимо оптимизированными моделями, полученными из половины наборов данных. 43 , Карта плотности и последующие производные модели были оптимизированы из половины наборов данных с использованием процедуры оптимизации реального пространства ( Рис. 6а ). Различия, существующие между двумя моделями, могут указывать на уровень неопределенности для определенных областей карты. Расстояния между соответствующими атомами Cα были рассчитаны для каждого остатка, и, как и ожидалось, аминокислоты с высокой плотностью в основной цепи и боковых цепях показали небольшие изменения. Среднеквадратичное отклонение (RMSD) между моделями, созданными на картах B1 и B2 ( Рис. 6б ) составляет 1,96 Å, и никакая разница в положениях Cα не превышает 2,5 Å. Это изменение в расположении атома коррелирует с потенциальной неопределенностью моделей из-за слабой плотности. Плотность на уровне боковой цепи является ключевым фактором изменения модели. Получение наилучшего соответствия плотности на уровне позвоночника и боковых цепей при использовании надлежащих ротамеров привело к изменению модели. Хорошо разрешенные регионы имели небольшие различия между двумя независимо генерируемыми моделями ( Дополнительный рис. 7а ), в то время как плохо разрешенные области имели большую вариацию Cα ( Дополнительный рис. 7б ). Аминокислоты в петлях, которые являются более беспорядочными по сравнению с областями β-листа, имеют более высокие значения RMSD, что приводит к более высокому уровню неопределенности (RMSD 1,87 Å в областях β-листа по сравнению с 2,10 Å для областей без β-листа, сравнивая все Атомы Cα из двух моделей). Кроме того, два набора данных имеют меньшее отклонение в ядре капсидного белка (1,51 Å RMSD) по сравнению с концевыми доменами (2,41 Å RMSD), что согласуется с нашим сравнением кристаллической структуры и модели крио-ЭМ. Наконец, FSC был вычислен ( Дополнительный Рис. 7c ) между уточненной моделью из четного набора данных (модель B1) и двумя независимыми картами плотности набора половин данных отдельно. Сходство между двумя графиками FSC указывает на то, что эта модель согласуется с обеими картами и что в половине наборов данных не произошло переоснащения.

    Рисунок 6: Модельное изменение между двумя независимыми моделями, полученными из независимых наборов данных.Рисунок 6: Модельное изменение между двумя независимыми моделями, полученными из независимых наборов данных

    ( a ) Блок-схема, описывающая процедуру проверки, используемую для двух независимых моделей. ( б ) Отклонение между независимыми моделями на уровне Cα. Синие области соответствуют низкому отклонению между независимыми моделями, а красные области соответствуют большему отклонению. ( c ) Кривая FSC между моделированными плотностями, сгенерированными из молекулярной модели (после сборки полного капсида) и экспериментальной карты плотности крио-ЭМ.

    Другим необходимым подтверждением как карты плотности, так и полученной модели всех атомов является их взаимное согласие. Как подтверждается FSC между комбинированной картой и соответствующей моделью, оба согласуются до ~ 4 Å при 0,5 FSC ( Рис. 6с ). Это значение согласуется с разрешениями, рассчитанными на основе оценки разрешения по золотому стандарту и «истинного FSC» ( Рис. 3а ). Обратите внимание, что на такую ​​меру влияет отсутствие растворителя в модели, что вызывает относительно плохое согласие на низких пространственных частотах по сравнению с обычными кривыми FSC.

    Сравнение моделей всех атомов между крио-ЭМ и кристаллом

    Мы напрямую сравнили качество нашей модели крио-ЭМ, полученной из объединенного набора данных (карта B, Дополнительный рис. 2 ) с рентгеновской кристаллической структурой, исследуя MolProbity 6 статистические оценки ( Таблица 1 ) и вариация, которая существовала между двумя моделями ( Рис. 7а, б ). Результаты MolProbity показали, что крио-ЭМ модель была статистически лучше, чем кристаллическая структура. Вероятно, это связано с тем, что мы использовали гораздо более строгие процедуры проверки и оптимизации моделей, чем те, которые были доступны для определения кристаллической структуры, что было предпринято более десяти лет назад. 8 , По сравнению с кристаллической структурой наша модель отличается более гибкими областями петли и концевыми плечами субъединиц. Подобно кристаллической структуре, субъединица А не имела видимой плотности, соответствующей первым 40 аминокислотам на N-концевом плече, вероятно, из-за взаимодействия с неупорядоченной РНК 44 , В субъединице C плотность цепи была прослежена от ARG26 на нашей карте ( Рис. 4б ), в то время как кристаллическая структура была прослежена только от остатка 40.

    Рисунок 7: Сравнение крио-ЭМ и рентгеновских структур BMV.Рисунок 7: Сравнение крио-ЭМ и рентгеновских структур BMV

    ( а ) Перекрывающиеся модели крио-ЭМ (зеленого, синего и красного) и рентгеновской модели (серый, идентификатор PDB: 1JS9). ( b ) Отклонение Cα между моделями, полученными из рентгеновских лучей и крио-ЭМ. Большие отклонения показаны красным, а небольшие отклонения показаны синим. Крио-ЭМ карта и модель ( с ) и рентгеновская карта 2Fo-Fc (3,55 σ ) и модель ( d ) асимметричной единицы.

    Что касается общего сгиба капсидного белка, то наша модель и кристаллическая структура находятся в хорошем согласии ( Рис. 7а ). Cα RMSD между крио-EM моделью и кристаллической структурой асимметричной единицы ( Рис. 7б ) было ~ 1,94 Å (для всех аминокислот, смоделированных в обеих структурах). В частности, вторичные структурные элементы имели меньшее отклонение (1,40 Å среднеквадратичное отклонение), чем петли (2,10 Å среднеквадратичное отклонение), и ядро ​​капсидных субъединиц в целом лучше сохранялось (1,68 Å среднеквадратичное отклонение) по сравнению с концевыми плечами (3,08 Å среднеквадратичное отклонение). Эти вычисленные значения RMSD были ожидаемыми, поскольку концевые остатки, взаимодействующие с РНК, вероятно, были переменными, и петли, которые подвергаются поверхностному воздействию, обычно имели высокие значения B- фактора в кристаллической структуре.

    Мы рассчитали FSC для сравнения плотности крио-ЭМ ( Рис. 7с ) к карте плотности 2Fo-Fc, полученной из нанесенных структурных факторов ( Рис. 7d ). Разрешение результирующей кривой FSC составило 3,8 Å при 0,5, что подтверждает заявленное разрешение нашей карты ( Дополнительный рис. 7г ). Карты демонстрируют функции высокого разрешения, такие как разделение β-нитей и некоторые боковые цепи. Связность капсидного белка, в частности ядра, соответствовала более низкой плотности в петлях. Количество видимых аминокислот в концевых плечах совпадает между двумя картами, даже несмотря на то, что полиаланиновый хвост был добавлен в кристаллическую структуру 8 Изменение существовало в центре асимметричной единицы, где в кристаллической структуре наблюдалась плотность, соответствующая присутствию иона магния в условиях кристаллизации. 8 Эта плотность отсутствовала на карте крио-ЭМ.

    Новости

    Шланговый противогаз - тип


    Гражданский противогаз ГП-7Б
    Противогаз ГП-7Б гражданский предназначен для защиты органов дыхания от отравляющих веществ, биологических аэрозолей, от широкого спектра аварийно химически опасных веществ, радиоизотопов

    Сроки и правила хранения противогазов, сроки проверки противогазов
    Противогазы являются индивидуальными защитными средствами дыхательных органов человека от негативного воздействия различных отравляющих и радиоактивных веществ, а также веществ бактериального характера.

    Виды противогазов и их назначение
    Противогаз – это высокоэффективное средство защиты от вредных и отравляющих веществ, содержащихся в окружающей среде в критической концентрации. Типовая его конструкция - прорезиненная маска с

    Срок годности противогаза
    В случае загрязнения воздуха вредными для человека веществами, применяется удобное средство защиты органов дыхания, лица и глаз – противогаз. Его производство рассчитано на большое количество населения

    Fallout 4 Противогаз На Карте
    Силовая броня X- 0. Fallout 4) . По своим параметрам она значительно превосходит довоенные аналоги. X- 0. 1 power armor) — модель силовой брони в Fallout 4. Модель данной силовой брони была разработана

    ПРОТИВОГАЗ - это... Что такое ПРОТИВОГАЗ?
    ПРОТИВОГАЗ — средство индивидуальной защиты органов дыхания, лица и глаз человека от вредных веществ, находящихся в атмосфере в виде паров, газов, аэрозолей. По принципу действия различают фильтрующие

    Фильтрующие противогазы - отвечаем на важные вопросы
    Противогаз – предназначен для защиты дыхательных путей и легких. Существует несколько видов противогазов. Изолирующие противогазыПо принципу защиты выделают две группы: Изолирующие. Такие

    Виды и назначение противогазов
    Наименование и марка Назначение, вид веществ от которых защищает Комплектация Примечание Фильтрующие противогазы Гражданские ГП-5, ГП-7 средство индивидуальной

    История противогаза
        Впервые необходимость использовать противогаз возникла в 1915 году, во время Первой мировой войны, когда отравляющие химические вещества стали применяться в больших количествах. И первой страной,